組織培養(yǎng)常遇到的問題-組培

1. 培養(yǎng)基配制注意事項(xiàng)

植物組織培養(yǎng)最常用MS培養(yǎng)基，包含十幾種化合物。有些化合物相遇會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，所以MS培養(yǎng)基需要配制多種高倍母液。

配制母液時(shí)，尤其涉及大量元素的母液時(shí)，一定要等一種成分溶解之后，再緩慢的添加另一種成分；切記一鍋煮，即不能將各種化合物一齊添加進(jìn)去。

2. 滅菌后培養(yǎng)基不凝膠或者凝膠偏軟

植物凝膠、瓊脂都對酸性條件敏感，pH 值低于5很難成膠或凝膠偏軟，切記高壓滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 值（5.5 - 6.0）。植物凝膠對二價(jià)陽離子濃度有要求，也就是相對于 MS 培養(yǎng)基，1 / 2 MS 培養(yǎng)基中植物凝膠要適當(dāng)增加用量。

另外滅菌后，倒出培養(yǎng)基前一定將培養(yǎng)基搖勻（帶防燙手套），因?yàn)榄傊芏却蟮讓雍扛?，容易造成培養(yǎng)基強(qiáng)度不均勻。

3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用過程中有無區(qū)別？

水解酪蛋白對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用，通常用量在 500 mg/L，不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，酶解更有利于發(fā)揮其作用。

4. 怎么溶解組培常用植物激素？

IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等應(yīng)先溶解于少量 95% 的乙醇中，再加水定容配制成母液。

如有結(jié)晶析出，可考慮用 1 / 10 體積的乙醇溶解后再定容；2，4 -D 易溶于堿性水溶液，可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容；KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解，再加水定容到一定的濃度。

5. 細(xì)胞分裂素使用濃度？

一般情況下在培養(yǎng)基中加入 0.1～10.0 mg/L 的細(xì)胞分裂素（6 -BA/KT/ZT)，多數(shù)用 1.0～2.0 mg/L，KT 濃度為 0.5～2 mg/L，濃度要根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料來調(diào)整。細(xì)胞分裂素可以單獨(dú)使用也可以與細(xì)胞生長素配合使用。

6. 哪些植物激素能高壓滅菌，哪些不能高壓滅菌？

IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高溫高壓滅菌。IAA、GA3、茉莉酸等不可高溫高壓滅菌，否則會(huì)分解失效，該類植物激素配制母液后需用 0.22 微孔濾膜過濾除菌，待培養(yǎng)基冷卻（50 - 60℃）后尚未凝膠前加入混勻。

7. 培養(yǎng)基的 pH 值會(huì)凝膠硬度有無影響？

有影響。

若將培養(yǎng)基 pH 值調(diào)的過高（大于 6），則培養(yǎng)基偏硬，增加接種的阻力，會(huì)對外植體造成損傷。

若將培養(yǎng)基 pH 值調(diào)的過低（小于 4.5），則培養(yǎng)基不能凝固，起不到固定外植體的作用。一般將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)節(jié)至 5.5～6.0 為宜。

8. 滅菌過程是否影響培養(yǎng)基的 pH 值？

培養(yǎng)基中的蔗糖和激素在高溫滅菌過程中容易酸化，培養(yǎng)基 pH 值滅菌后會(huì)有所下降，滅菌前培養(yǎng)基的 pH 值偏低可能導(dǎo)致培養(yǎng)基不凝或偏軟。要求偏酸性的培養(yǎng)基可適當(dāng)增加瓊脂或植物凝膠的用量。

9. 應(yīng)用 75% 的酒精進(jìn)行種子消毒的過程中需要注意哪些問題？

種子在消毒過程中使用 75% 的酒精應(yīng)慎重，酒精滲透力極強(qiáng)，消毒時(shí)間過長會(huì)直接影響種子發(fā)芽率，所以建議消毒時(shí)間不應(yīng)超過 1 min。

10. 原始繁殖材料的消毒

組培原始繁殖的外植體消毒，直接影響整個(gè)培養(yǎng)過程。

從室外采回來的外植體需進(jìn)行消毒，首先用自來水沖洗外植體，沖洗時(shí)間可根據(jù)采集部位不同而定，一般在 5～15 分鐘即可；在超凈臺(tái)中進(jìn)行藥劑的處理，常用的藥劑處理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯酸鈉溶液和 0.1～0.2% 的升汞溶液，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料而定。應(yīng)注意的是經(jīng)升汞滅菌的外植體必須用無菌水沖洗 6～8 次。

11. 怎樣處理植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的各種污染？

植物組織培養(yǎng)過程中的污染來源主要分為 3 種：真菌、細(xì)菌、組織培養(yǎng)過程中的污染源

在操作過程中，難免有菌落入培養(yǎng)基或植物材料上導(dǎo)致污染。不正確操作也會(huì)增加污染幾率。

預(yù)防措施：通風(fēng)、保持室內(nèi)空氣干燥、紫外殺菌等。污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。

污染原因判斷：

（1）培養(yǎng)基污染 

若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，可確定是人為引起的污染。比如：培養(yǎng)基滅菌不徹底，開瓶時(shí)間過長，滅菌后存放時(shí)間過長，高溫蒸汽滅菌器的溫度、壓力、時(shí)間沒有正確設(shè)，過濾滅菌過程中濾膜孔徑選擇，過濾滅菌器的滅菌處理，過濾滅菌操作等。這些均會(huì)影響培養(yǎng)基的滅菌效果。

措施：嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求，滅菌規(guī)程操作。

（2）外植體污染 

若污染菌類是從材料周圍長起，且發(fā)生在 5 天以后，則說明是材料帶的內(nèi)生菌。可能是接種用具滅菌不徹底，接種時(shí)材料被污染；

若從培養(yǎng)基以下開始長菌，發(fā)生時(shí)間較早，且有從里向外的趨勢，則說明是切口引起的污染，原因可能是未剪去兩個(gè)切口或者雖剪去切口但是所用器具帶菌；或者是未及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染苗，接種過程中引起交叉污染；

措施：取材時(shí)應(yīng)仔細(xì)選擇，以減少污染的發(fā)生。

（3）操作環(huán)節(jié)污染 

接種室是否清潔、干燥、密封，是否經(jīng)常用紫外燈照射、甲醛熏蒸、70% 的酒精噴霧殺菌等；超凈工作臺(tái)擺放物品雜亂，長時(shí)間不換濾網(wǎng)，導(dǎo)致凈化能力降低；接種用具滅菌不徹底引起污染；操作不正確等。

措施：每次接種前半個(gè)小時(shí)，用 20% 的新潔爾擦洗室內(nèi)設(shè)備、工作臺(tái)面，再用紫外燈照射 20 min，噴灑 70% 的乙醇進(jìn)行消毒。除了培養(yǎng)基、接種材料、器具和用具保證無菌外，同時(shí)在接種時(shí)還需要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。

措施：

（1）真菌污染后，如果已形成孢子，則必須經(jīng)高壓滅菌后扔掉；若是細(xì)菌污染，只要及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感染菌的部分剪下轉(zhuǎn)接，材料仍可以用。

（2）用抗生素等殺菌藥劑處理。至今還未發(fā)現(xiàn)哪種抗生素能夠?qū)Ω鞣N菌都有效，并且常影響植物材料的正常生長分化。另一些藥劑，雖有的殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，也無法利用。

12. 外植體的選擇

為了使接種后的誘導(dǎo)得以成功，選擇的外植體應(yīng)該是幼嫩、處于生長旺盛時(shí)期的，選擇的外植體的體積不能過小，如若過小則會(huì)影響愈傷組織的形成，從而影響進(jìn)一步的分化。因此，一般接種的外植體體積在 0.5～1.0 cm2 的范圍內(nèi)即可。最適的為莖尖、帶芽、莖段，也可以利用葉子、子葉、根段、花器官組織等。

13. 植物莖段組織培養(yǎng)需要注意哪些問題

以莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)比較容易，一般取植物的嫩莖切段作為外植體，切成 0.5～1 cm 長的小段進(jìn)行接種，保證每個(gè)莖段有一個(gè)芽點(diǎn)和一片葉子，將芽點(diǎn)部位以下垂直插入培養(yǎng)基凝膠中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

14. 外植體接種需要注意的操作事項(xiàng)

接種前首先進(jìn)行滅菌消毒，接種所用的鑷子、解剖刀、剪刀等工具需要提前高溫高壓滅菌，提前 10 分鐘打開超凈工作臺(tái)，滅紫外 15～20 min，操作人員要用 75% 的酒精棉球擦手、工作臺(tái)和器皿，解剖刀和鑷子等隨時(shí)擦酒精灼燒，晾涼后備用。

在無菌培養(yǎng)皿或?yàn)V紙上切割外植體，接種到培養(yǎng)基表面，注意瓶口傾斜接近酒精燈火焰。

15. 組織培養(yǎng)中材料褐化現(xiàn)象

不同品種以及生理狀態(tài)引起的褐化狀態(tài)不同。培養(yǎng)基過高濃度的無機(jī)鹽及高水平細(xì)胞分裂素會(huì)使褐化現(xiàn)象加重。培養(yǎng)條件不當(dāng)，例如光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加重外植體的褐變程度。

防治措施：

選擇合適的外植體：選擇生長處于旺盛的外植體，可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。

合適的培養(yǎng)條件：無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。

使用抗氧化劑：在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP 等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外使用 0.1%～0.5% 的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。

連續(xù)轉(zhuǎn)移：對容易褐變的材料可間隔 12～24 小時(shí)的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理 7～10 天后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。

16. 材料玻璃化問題

植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明、水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。

玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥，試管苗生長緩慢、玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，繁殖系數(shù)有所下降。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

愈傷組織的玻璃化問題主要表現(xiàn)在培養(yǎng)過程中愈傷組織松散、脆易碎。葉子或是長出的愈傷一段時(shí)間后在其周圍出現(xiàn)水漬化，繼而影響整個(gè)培養(yǎng)基。

防治措施: 

在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量及含氮化合物的用量，選用低 NH4 +水平的 B5 培養(yǎng)基，都能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；

增加光照，對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；在培養(yǎng)基中添加活性炭、馬鈴薯汁、間苯三酚等可有效的減輕和防止玻璃化。

17. 材料水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯

可能原因：表面殺菌劑過量，消毒時(shí)間過長，外植體選用不當(dāng)（部位或時(shí)期）。

改進(jìn)措施：調(diào)換其他殺菌劑或降低濃度，縮短消毒時(shí)間，試用其他部位，生長初期取材。

18. 材料長期培養(yǎng)幾乎無反應(yīng)

可能原因：培養(yǎng)基不適合，生長素的選擇和用量不當(dāng)，植物激素對生長發(fā)育和生理過程的調(diào)節(jié)作用，往往不是某一種植物激素的單獨(dú)效果；環(huán)境溫度不適宜。

改進(jìn)措施：

更換培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)基成分，尤其是調(diào)整鹽離子濃度；

調(diào)整激素的種類與配比，增加生長素用量，例如使用人工合成的生長素類似物 2，4 -D 等可有效促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長，新器官的分化和形成；

調(diào)整培養(yǎng)溫度等環(huán)境條件。

19. 愈傷組織生長過旺疏松

可能原因：由于培養(yǎng)基中激素添加過量，培養(yǎng)室溫度偏高，礦物質(zhì)等無機(jī)鹽含量不當(dāng)?shù)纫蛩匾鸬摹?o:p>

改進(jìn)措施：根據(jù)不同的品種、不同組織、不同器官，應(yīng)適當(dāng)減少激素用量，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整無機(jī)鹽（尤其是銨鹽）含量，適當(dāng)提高瓊脂用量增加培養(yǎng)基硬度，避免愈傷組織生長過旺和疏松現(xiàn)象發(fā)生。

20. 愈傷組織生長緩慢太緊密

可能原因：細(xì)胞分裂素和生長素的用量過多，糖濃度過高。

改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，調(diào)整細(xì)胞分裂素與生長素比例，降低糖濃度。

21. 愈傷組織分化率低，畸形，分化出的芽多為葉狀芽或叢芽，芽生長困難，不易成苗。培養(yǎng)時(shí)間長時(shí)，再次愈傷組織化

可能原因：生長素用量偏高，溫度偏高。

改進(jìn)措施：減少生長素用量，可以通過分化培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中添加 GA3（濃度在 0.5～2 mg/L 之間）解決，并適當(dāng)降低愈傷組織的培養(yǎng)溫度。

22. 叢生苗過于細(xì)弱，不適于生根或移栽

可能原因：細(xì)胞分裂素濃度過高或赤霉素使用不當(dāng)，產(chǎn)生過多的不定芽；溫度過高，光照短，光強(qiáng)不足；不及時(shí)的轉(zhuǎn)移和分切，生長空間小。

改進(jìn)措施：

減少細(xì)胞分裂素用量，免用赤霉素；

延長光照時(shí)間，增強(qiáng)光照；

及時(shí)轉(zhuǎn)接；

降低接種密度；

更換透氣的封口膜等。

23. 組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)黃化

可能原因：培養(yǎng)基中 Fe 的含量不足，各種礦質(zhì)營養(yǎng)不均衡；培養(yǎng)環(huán)境通氣不良，瓶內(nèi)有害氣體積累（乙烯、氨氣、甲醛）等會(huì)引起植物材料黃化脫落；激素配比不當(dāng)；糖用量不足或長時(shí)間不轉(zhuǎn)移；pH 值變化過大；培養(yǎng)溫度不適；光照不足等。

改進(jìn)措施：

改善組培條件，在配制培養(yǎng)基過程中檢查儀器設(shè)備是否準(zhǔn)確；

降低組培苗的接種密度，及時(shí)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物；

使用透氣的封口膜改善瓶內(nèi)通氣狀況；

適當(dāng)調(diào)節(jié) pH 值、激素配比和無機(jī)鹽濃度；

控制培養(yǎng)室內(nèi)溫度，適當(dāng)增加光照。

24. 植物組培培養(yǎng)基都有哪些？

MS 培養(yǎng)基：1962 年穆拉辛格和斯庫格為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，其中硝酸鹽的濃度高，適合植物原生質(zhì)體、細(xì)胞和組織培養(yǎng)。

B5 培養(yǎng)基：1968 年甘伯爾格為大豆細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，銨的濃度低。適合木本植物的組織和細(xì)胞培養(yǎng)。

富鹽平衡培養(yǎng)基：是目前使用最廣泛的一類，特點(diǎn)是：無機(jī)鹽濃度高，微量元素種類齊全，濃度高；元素間比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖能力、穩(wěn)定性好、營養(yǎng)豐富，一般培養(yǎng)時(shí)無需再加入有機(jī)成分。

高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：代表性培養(yǎng)基有 B5、N6、SH。特點(diǎn)是：硝酸鉀濃度高，氨態(tài)氮濃度低，含有較高濃度的硫胺素（VB1）。

中鹽培養(yǎng)基：大多是在 MS 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行改良設(shè)計(jì)。特點(diǎn)是：大量元素?zé)o機(jī)鹽為 MS 的一半，微量元素種類減少、含量增高。維生素種類比 MS 增多，例如增加了生物素、葉酸等。

低鹽培養(yǎng)基：無機(jī)鹽、有機(jī)成分含量濃度低，多用作生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

25. 木本植物（油料植物）組織培養(yǎng)中遇到再生苗無法生根時(shí)怎么辦？

一般常用的 1 / 2MS 或者 1 / 2WPM 基本能夠滿足。如果增殖用的都生產(chǎn)正常，到生根的時(shí)候出現(xiàn)落葉，只能通過排除法一樣樣分析。

首先看是不是培養(yǎng)溫度太高，使用瓶蓋后透氣性差，導(dǎo)致乙烯積累。其次，可以適當(dāng)添加少量分裂素，或者更換生長素，以及多種生長素混合使用。

26. 培養(yǎng)基中添加糖類作為碳源物質(zhì)，有何重要作用？

碳源為植物細(xì)胞提供能量來源，蔗糖較葡萄糖能更好地調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的滲透壓。微生物生長所需的碳源最常用的是葡萄糖。采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可一定程度上減少微生物的污染。

生長素和蔗糖濃度決定愈傷組織中維管束的類型與數(shù)量。

27. 用于植物原生質(zhì)體制備的材料，以及常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑

用于植物原生質(zhì)體的材料需要選取生長旺盛的細(xì)胞，幼嫩的組織。無菌試管苗的葉片、胚軸及子葉、花藥，以及愈傷組織（懸浮細(xì)胞）等。

常用的調(diào)節(jié)原生質(zhì)體滲透壓的穩(wěn)定劑主要有甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。滲透壓濃度一般為 0.3～0.8 mol/L。

28. 組培苗移栽需要注意的問題

在移栽前打開三角瓶的封口膜，煉苗 3～5d 后取出小苗，用流水洗凈根部的培養(yǎng)基，然后移栽到盛有滅過菌的蛭石營養(yǎng)缽中過度一下，但要注意不可直接向營養(yǎng)缽中澆營養(yǎng)液（容易長菌），用透明的塑料薄膜罩住小苗 3～5d 后移栽到土里。

29. 光照強(qiáng)度多少 lux 是如何計(jì)算的

光照強(qiáng)度 = 光通量/單位面積。Lux 的換算比較抽象，一般以燭光為計(jì)算單位，現(xiàn)在所用的以電源發(fā)光的光源，記作國際燭光，即 25 瓦特的電燈其光強(qiáng)度等于 25 國際燭光。1 標(biāo)準(zhǔn)燭光 = 10.76 Lux。

30. LED 光源在植物組織培養(yǎng)中的選擇

光是植物生長中最重要的環(huán)境因子之一，并不是所有的光都有助于植物的光合作用。LED 光源 460nm 左右的藍(lán)光和 660nm 左右的紅光是植物最需要的光波，對植物的生長發(fā)育起著關(guān)鍵性的作用。