組織培養(yǎng)污染產(chǎn)生的原因及防治措施(黃化&褐化)

  組織培養(yǎng)過程中污染的來源

  外植體自身帶菌

  許多植物都是栽培在室外，而空氣環(huán)境中有大量微生物存在，這些微生物可通過植物自然的孔口或傷口進(jìn)入植物內(nèi)部，也有一些兼性腐生菌，可由外植體或通過相應(yīng)的侵入機(jī)制侵入植株內(nèi)部，如果在接種操作前對這些認(rèn)識不足，對外植體消毒不嚴(yán)，就很容易發(fā)生污染現(xiàn)象。

  培養(yǎng)基或接種工具滅菌不徹底

  在對培養(yǎng)基滅菌過程中，如果滅菌時間過短、滅菌時溫度達(dá)不到要求、滅菌鍋壓力記數(shù)不準(zhǔn)等因素都有可能導(dǎo)致培養(yǎng)基滅菌不徹底，使一些病原微生物殘留在培養(yǎng)基中，一旦接種后就會造成污染。使用滅菌不徹底的接種工具，滅過菌的接種工具存放時間過長，都會導(dǎo)致在生產(chǎn)中造成污染，所以生產(chǎn)中要做好培養(yǎng)基和接種工具的滅菌和消毒工作。

  接種室消毒不嚴(yán)

  在組培生產(chǎn)過程中，除了植物本身外，大部分污染來源便是來自接種操作室。因為在接種操作室中，未過濾的空氣中含有大量的微生物，這些微生物可隨著操作人員或植株接觸時而發(fā)生污染，所以接種室消毒不嚴(yán)，也易引發(fā)污染發(fā)生。

  人員因素

  在整個操作室內(nèi)，人員是最大的帶菌者，其不管在毛發(fā)或是衣服等，都隱藏著數(shù)不清的微生物。這些微生物的存在都可能造成一定的危害。為此在進(jìn)入操作室前，接種人員的工作服、鞋帽都必須進(jìn)行消毒處理，進(jìn)入接種室必須換上消毒過的鞋帽;接種前，接種人員必須認(rèn)真洗手，還要用70%的乙醇棉球擦拭雙手，這樣在一定程度上可減輕污染的危害。

  超凈工作臺上的濾網(wǎng)過濾不徹底

  超凈工作臺使用過久，或保養(yǎng)不當(dāng)，而造成濾網(wǎng)壞掉或灰塵過多，導(dǎo)致在接種操作時對空氣過濾不徹底，也易產(chǎn)生污染。

  栽培過程污染

  在栽培室，組培瓶外和外界氣體交換時，亦會有一些微生物進(jìn)入。污染幾率取決于空氣中帶菌密度與組培瓶空氣交換率。

  防止污染的方法

  認(rèn)真做好外植體的選擇和消毒工作，防止外植體帶菌

  對外植體的選擇要考慮選擇的時間和部位，盡量選取帶菌少的材料，在時間上一般在植株的生長旺盛季節(jié)，如春季和秋季病原微生物數(shù)量相對要少些，對于外植體的部位一般以幼嫩的部位較好。

  另外要做好外植體的消毒工作，目前外植體消毒常用藥劑有：70%～75%的乙醇溶液，0.3%～0.6%的次氯酸鈉溶液和0.1%的升gong溶液。選用何種消毒劑和消毒時間要根據(jù)外植體的幼嫩程度和部位確定，一般要求既將外植體表面的微生物殺死，又要求盡可能少傷害外植體組織和表層細(xì)胞。在生產(chǎn)實踐中防止外植體污染，也可實行多次滅菌和交替滅菌相結(jié)合的辦法，最終達(dá)到消滅雜菌的目的。

  改善接種室和培養(yǎng)室的環(huán)境條件，保證接種與培養(yǎng)環(huán)境清潔無菌

  與外植體自身帶菌所產(chǎn)生的污染相比,操作污染和環(huán)境污染是可以克服的。在組培生產(chǎn)中，真菌的污染一般與環(huán)境有關(guān)，細(xì)菌污染與接種材料及工具有關(guān)。生產(chǎn)中要通過定期做好對接種室與培養(yǎng)室消毒工作，減少環(huán)境中的微生物數(shù)量，減輕對污染的危害。為此，在接種前接種室要認(rèn)真做好消毒工作，且超凈工作臺在接種前，認(rèn)真擦洗，紫外燈要開20～30min左右。培養(yǎng)室的相對濕度應(yīng)控制在70%左右，對每件物品放到超凈工作臺上，都要用75%酒精認(rèn)真擦洗一遍，方可放到臺面上，只有這樣在一定程度上可控制污染程度。

  操作人員嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程

  接種人員在接種操作中，應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范要求。接種人員的工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品要定期進(jìn)行濕熱滅菌，在超凈工作臺的操作區(qū)內(nèi)，不要放入過多的待用物品，避免氣流被擋住產(chǎn)生污染。定期清洗或更換超凈工作臺過濾器，接種前15～20min打開風(fēng)機(jī)，風(fēng)速調(diào)整到20～30m/min，并對臺面用75%酒精噴霧消毒，工作人員進(jìn)入操作室前必須對工作服、鞋帽進(jìn)行消毒處理，進(jìn)入接種室必須換上消毒過的鞋帽，接種前，接種人員必須認(rèn)真洗手，還要用70%的乙醇棉球擦拭雙手，只有接種過程中嚴(yán)格遵守操作要規(guī)范，才可避免因人為因素造成污染。

  培養(yǎng)基及接種工器具要嚴(yán)格滅菌，確保滅菌質(zhì)量

  在對培養(yǎng)基和接種工具滅菌時，要先檢查滅菌鍋的使用情況，發(fā)現(xiàn)問題要立即檢修。在滅菌過程中要絕對保證滅菌應(yīng)達(dá)到的壓力、時間，確保滅菌質(zhì)量。一般要求壓力應(yīng)達(dá)到0.1個大氣壓，時間維持在15～20分鐘，并且壓力表降到零后不能馬上出鍋，防止外界環(huán)境的冷空氣倒吸入已滅菌的培養(yǎng)瓶內(nèi)引起真菌污染，應(yīng)待鍋內(nèi)稍冷卻后再出鍋。對組培生產(chǎn)過程中培養(yǎng)容器封口采用塑料蓋、膠塞、棉塞、薄膜等材料，在使用前要認(rèn)真做好清冼和消毒工作，不符合要求堅決不用。在分裝培養(yǎng)基時，勿觸瓶口，防止培養(yǎng)基粘在瓶口上，引起污染，瓶口封好后要檢查封口是否破損，扎瓶口位置適當(dāng)，松緊適宜。對已污染組培瓶要經(jīng)高壓滅菌后再清洗。

  在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素

  這是目前較常用的方法，抗生素可以直接加入到培養(yǎng)基中，也可以用抗生素噴灑或浸泡外植體。但植物種類不同，所用抗生素的種類、濃度和處理時間也不同，因此必須對不同植物采用不同的抗生素的種類、濃度和處理時間進(jìn)行實驗探討。

  一般情況下，為消除革藍(lán)氏陽性菌對有些木本植物污染莖段組培苗，可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素、頭孢等混合物，可使細(xì)菌完全被消除。另外用頭孢菌素Ⅱ消除某些觀賞植物外植體中的內(nèi)生菌也有非常明顯的效果。

  利用病毒在植株體內(nèi)分布不均勻的原理，生產(chǎn)脫毒苗

  因為病毒在生長點區(qū)域幾乎不存在，且病毒也難以長到頂芽的分生組織，所以切取頂芽的分生組織進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過組織培養(yǎng)技術(shù)就可培養(yǎng)成無病毒植株，而且脫毒效果好，后代遺傳性穩(wěn)定，所以是目前生產(chǎn)無病毒苗最安全、最重要的一條途徑。

  利用培養(yǎng)基中高鹽或高糖的濃度，抑制微生物的生長

  在培養(yǎng)基中有一些高鹽或高糖的濃度可抑制微生物生長，或單寧酸存在時也可以達(dá)到抑制微生物生長的效果。

  減少培養(yǎng)基中的某些有機(jī)成分，可抑制微生物的生長繁殖

  培養(yǎng)基中有機(jī)物如VB1、VB6、煙酸等有機(jī)成分，是某些細(xì)菌生長的必需物質(zhì)，除去這些有機(jī)物后，細(xì)菌無法生長發(fā)育，逐漸死亡減少。這樣也可在一定程度上減輕污染所帶來的危害。

  組培生產(chǎn)中污染的發(fā)生是不可忽視的環(huán)節(jié)，在生產(chǎn)過程中思想上要高度重視，行動上要有嚴(yán)格遵守操作規(guī)范，才能在一定程度上減輕污染所帶來的危害。

  組培苗的黃化及防治

  組培苗的黃化

  黃化是指在組培過程中由于培養(yǎng)基成分、環(huán)境、激素、碳水化合物等各種因素引起的幼苗整株失綠，全部或部分葉片黃化、斑駁。這一現(xiàn)象在植物組織培養(yǎng)中比較常見，特別在部分木本植物、花卉中較為常見。

  影響組培苗黃化的因素

  1、培養(yǎng)基中Fe的含量不足, 各礦質(zhì)營養(yǎng)不均衡;

  2、培養(yǎng)環(huán)境通氣不良，瓶內(nèi)乙烯含量升高;

  3、激素配比不當(dāng);

  4、PH值變化過大;

  5、糖用量不足或長時間不轉(zhuǎn)移糖已耗盡;

  6、培養(yǎng)溫度不適;光照不足等。

  防治組培苗黃化的方法

  1、首先在配制母液和培養(yǎng)基的制作過程中，要檢查儀器設(shè)備是否準(zhǔn)確，還要認(rèn)真細(xì)致地核對每項稱量的每一個環(huán)節(jié);

  2、使用透氣的封口膜以改善瓶內(nèi)通氣狀況;

  3、適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值、激素配比和無機(jī)鹽濃度;

  4、配制培養(yǎng)基時切記不要忘記加糖,及時轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物;

  5、控制培養(yǎng)室內(nèi)的溫度,適當(dāng)增加光照;

  6、在培養(yǎng)基中添加抗生素類物質(zhì)如青霉素、鏈霉素、頭孢霉素等，有時也會出現(xiàn)幼苗黃化現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)減少用量或停止使用。

  組培苗的褐變及防治

  組培苗的褐變

  很多種類的植物體中含有大量多酚類化合物，切取芽時的創(chuàng)傷會激活組織中的多酚氧化酶，將多酚類物質(zhì)氧化為棕褐色的醌類物質(zhì)，使外植體的切口處發(fā)生褐變，產(chǎn)生可見的茶色、褐色或黑色，此即謂“酚污染”。醌類物質(zhì)會滲透到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基褐化，其結(jié)果是嚴(yán)重影響培養(yǎng)物的生長和分化，甚至造成培養(yǎng)物死亡。在木本植物，尤其是熱帶木本植物及少量草本植物中，此現(xiàn)象較為嚴(yán)重。

  影響褐變的因素

  植物的種類褐基因型、外植體的來源和生理狀況以及培養(yǎng)基的成分都會不同程度的影響褐變的程度。一般木本植物的外植體比較容易產(chǎn)生褐變現(xiàn)象，在成年樹尤其嚴(yán)重。培養(yǎng)基中含酚過高會導(dǎo)致褐變，含過高濃度的無機(jī)鹽和肌醇也會加劇外植體的褐變。6-芐氨基嘌呤(6-BA)和激動素(KT)也有誘導(dǎo)褐變的作用。強(qiáng)光和高溫同樣會促進(jìn)褐變現(xiàn)象。

  防治褐變的方法

  1、在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑是防止褐變的有效措施。

  常用的抗氧化劑有抗壞血酸(VC)、檸檬酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等，該類藥劑一般需用濃度為50-200mg/L。

  具體方法如下：

  (1)用經(jīng)過濾滅菌的抗氧化劑溶液洗滌剛切割的外植體傷口表面;

  (2)將抗氧化劑加入固體培養(yǎng)基的表層;

  (3)將剛切割的外植體浸入其中一定時間，

  (4)或者在抗氧化劑溶液中切割和剝離外植體。

  (5)必要時還可以將幾種抗氧化劑結(jié)合使用。

  2、在培養(yǎng)基中加入活性炭，吸附對生長有抑制作用的褐色醌類物質(zhì)。

  一般認(rèn)為，活性碳主要吸附非極性物質(zhì)及色素大分子，可以減少一些有害物質(zhì)的影響，但是具體吸附的選擇性很差，溫度低時吸附力增強(qiáng)，溫度高時吸附力減弱，甚至?xí)馕?。通?；钚蕴康氖褂脻舛葹?.5-10g/L。大量活性炭的加入會削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加些瓊脂;很細(xì)的活性炭容易沉淀，因此通常在瓊脂將要凝固時，需輕輕搖動培養(yǎng)瓶;應(yīng)當(dāng)注意的是：活性炭也能吸附培養(yǎng)基中的激素類物質(zhì)，影響莖尖的分化和生長，因此在使用活性炭的場合，需要適當(dāng)提高培養(yǎng)基中激素的濃度。

  3、不斷地(每隔1～2d)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上，以擺脫老培養(yǎng)基中褐色物質(zhì)的不利影響。在使用液體培養(yǎng)基的情況下，這種方法相當(dāng)有效。

  4、為了防止外植體的褐變，需要選取酚類化合物含量較低的實驗材料，選擇無機(jī)鹽含量較低，不加肌醇的培養(yǎng)基，并在較弱的光線或黑暗的條件中進(jìn)行培養(yǎng)。

  5、易發(fā)生褐變的植物在進(jìn)行組織培養(yǎng)時，先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(即培養(yǎng)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中)2-3天(如果分泌物多，如利用花魔芋的球莖進(jìn)行組織培養(yǎng)時，適當(dāng)延長預(yù)培養(yǎng)時間并多次更換培養(yǎng)基)，再培養(yǎng)到添加了激素的培養(yǎng)基上。

  組織培養(yǎng)的條件和培養(yǎng)基制備注意事項

  1、植物組織培養(yǎng)的整個操作和培養(yǎng)過程都要求在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行，無菌是組織培養(yǎng)成功的首要條件。操作過程在接種室內(nèi)超凈工作臺上進(jìn)行;外植體材料要進(jìn)行表面消毒;配制的培養(yǎng)基要進(jìn)行高壓滅菌消毒。

  2、溫度處理操作和培養(yǎng)過程都是在恒溫條件下進(jìn)行，一般在23—27℃之間，熱帶植物可偏高些，脫毒植物需要高溫處理。

  3、光照處理植物的器官必須有光，某些植物器官的生成是在無光條件下，但它的生長和發(fā)育必須有光。莖尖的生長及試管苗的繼代增殖以3000-5000lux光照強(qiáng)度適宜;生根試管苗以3000lux適宜。光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、器官的分化有不同的影響。光周期誘導(dǎo)一般是16h，黑暗是12h，對光周期敏感植物要掌握光照時間，否則影響植物的分化。

  4、培養(yǎng)基的酸堿度因植物的種類不同而有區(qū)別，大多數(shù)植物要求在5.8之間，喜酸性培養(yǎng)的植物要求的酸堿度較嚴(yán)格。

  培養(yǎng)基的成分

  1、用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基迄今不下幾十種。歸納起來任何一種培養(yǎng)基均有以下幾部分組成：無機(jī)鹽(大量元素、微量元素)，有機(jī)化合物(蔗糖、維生素類、氨基酸、核酸及其他水解化合物)，鐵鹽螯合劑，植物激素。

  植物激素的純度對于組織培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。接種的外植體，其分化速度(長芽)和分化方向(長根)，均取決于所加激素的種類、數(shù)量及比例。簡言之，主要是生長素和細(xì)胞分裂素的加入量以及兩者的比例。一般生長素類包括吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸;細(xì)胞分裂素類包括激動素、芐基氨基嘌呤、二甲基丙烯氨基嘌呤。

  培養(yǎng)基中的糖類主要是蔗糖，少數(shù)情況下使用葡萄糖。大量生產(chǎn)可使用蔗糖。糖在培養(yǎng)基中的作用是提供碳源，同時用于維持滲透平衡，瓊脂是固體培養(yǎng)基中的成分，作為固化劑支持。培養(yǎng)物在培養(yǎng)基的成本消耗中，瓊脂占有相當(dāng)大的比例，培養(yǎng)基中瓊脂的加入量一般為4-7g。

  2、在組織培養(yǎng)生產(chǎn)中，培養(yǎng)基的制備對母液的需求量相當(dāng)大，需一批一批地連續(xù)配制。為簡化配制過程，提高工作效率，一般將各種所需藥品先配制成高濃度溶液，貯備起來。到配制培養(yǎng)基時，按要求的濃度取一定量稀釋即可;我們稱這些高濃度的溶液為貯備液，習(xí)慣上稱母液。

  制備母液時，先將所有藥品分成幾組，每組藥品制成一種母液。分組的原則是同組藥品混合溶解時不會發(fā)生質(zhì)的變化，也不產(chǎn)生沉淀。一般將藥品分成5組：大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)化合物類和植物激素。其中植物激素母液有若干種，每種激素都先制成1mg/ml的溶液。

  母液制備注意事項

  1、藥品稱量要盡可能準(zhǔn)確。大量元素用百分之一天平稱取，而微量元素、有機(jī)物類、植物激素等，則必須使用萬分之一的天平。

  2、母液配制完畢注入試劑瓶后，一定要標(biāo)明母液的名稱、序號、濃度和配制日期等。

  3、配制好的母液應(yīng)放置在冷藏箱內(nèi)保存，尤其是有機(jī)物和激素類。

  培養(yǎng)基的配制

  1、將用于配制培養(yǎng)基的容器洗凈，加入培養(yǎng)基總量四分之三的蒸餾水，放入所需的瓊脂和糖，然后加熱溶解。在加熱過程中應(yīng)不斷地攪拌，以避免瓊脂粘鍋或溢出。

  2、待瓊脂和糖完全溶解后，按順序加入各貯備液以及所需的植物激素。

  3、用蒸餾水定容補充由于加熱蒸發(fā)所損失的體積。

  4、用蒸餾水調(diào)整pH。

  5、通過漏斗或下口杯將培養(yǎng)基注入組組織培養(yǎng)容器內(nèi)，注入量為瓶容積的十分之一左右。灌裝要迅速，盡可能避免培養(yǎng)基粘在瓶壁上，且應(yīng)在培養(yǎng)基未冷卻之前灌裝完畢。

  6、用封口膜或含透氣膜的塑料蓋將瓶口或試管口封嚴(yán)。

  7、將封裝好的組織培養(yǎng)容器碼放在高壓滅菌鍋內(nèi)。于105Pa壓力、121℃下滅菌20分鐘。如使用小型手提式滅菌鍋時，一定要注意，當(dāng)鍋內(nèi)壓力上升時，先反復(fù)放氣數(shù)次，將鍋內(nèi)空氣排盡以后，再計算時間，否則達(dá)不到高壓滅菌的效果。

  8、對于一些受熱易于分解的物質(zhì)，如維生素類，可采取先過濾滅菌的方法。待培養(yǎng)基滅菌后，尚未冷卻之前(40℃左右)加入并搖勻。經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)基可在室溫下存放3-5天，或在冷藏箱內(nèi)存放10天左右，最好在短時間內(nèi)用完。