甜菜雄性不育系高效組培再生體系的建立

甜菜是我國(guó)重要的糖料作物之一，在北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。然而隨著甜菜機(jī)械化作業(yè)程度的不斷提高，特別是大規(guī)模集約化生產(chǎn)的不斷推進(jìn)，甜菜生產(chǎn)中病蟲(chóng)草害越來(lái)越重，通過(guò)人工防治病蟲(chóng)害及除草成本越來(lái)越高。因此，順應(yīng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展方向、結(jié)合甜菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求開(kāi)展甜菜抗性轉(zhuǎn)基因育種研究可加速育種進(jìn)程，也是今后甜菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然選擇。

  部分植物基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)相對(duì)成熟，但甜菜轉(zhuǎn)基因育成品種一直未見(jiàn)報(bào)道。甜菜轉(zhuǎn)基因品種未能產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用是由多種原因造成的，其中甜菜很難建立起高效的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系是其中一個(gè)重要的限制因素。本研究通過(guò)對(duì)甜菜雄性不育系的多種外植體進(jìn)行再生培養(yǎng)，研究分析影響甜菜外植體再生的因素，建立并優(yōu)化甜菜植株再生體系，為甜菜轉(zhuǎn)基因開(kāi)展前期基礎(chǔ)性工作。

  1 材料與方法

  1.1 供試材料

  供試材料為甜菜雄性不育系32467，由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物研究所提供。

  1.2 方法

  1.2.1 無(wú)菌苗培養(yǎng) 將磨掉花萼完整的甜菜種球，用百菌清(霜霉煙劑)密閉熏蒸24 h后，在超凈工作臺(tái)中移至滅過(guò)菌的三角瓶中，隨后用75%乙醇消毒2 min，無(wú)菌水漂洗3次;再用0.1%的氯化汞處理20 min，無(wú)菌水漂洗3次;后將消毒后的種子接種于MS培養(yǎng)基上，置于組培室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 23 ℃。

  1.2.2 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的選擇 在超凈工作臺(tái)上，將無(wú)菌苗置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將無(wú)菌苗的葉柄切成1 cm左右的小段，隨后將葉柄接種于含有不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的分化培養(yǎng)基(表1)中進(jìn)行分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，以篩選出誘導(dǎo)葉柄分化成不定芽的適培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基接種葉柄120個(gè)。

  表1 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)

  1.2.3 高誘導(dǎo)率外植體的篩選 在超凈工作臺(tái)中，將無(wú)菌苗的下胚軸、葉柄、叢生芽塊均切成長(zhǎng)約1 cm的小段，分別置于篩選出的佳不定芽誘導(dǎo)率培養(yǎng)基，根據(jù)不同類(lèi)型外植體誘導(dǎo)率，確定誘導(dǎo)率高的培養(yǎng)基。3種不同類(lèi)型的外植體均接種120個(gè)。

  1.2.4 繼代培養(yǎng)基的選擇 當(dāng)誘導(dǎo)的叢生芽長(zhǎng)到約1 cm時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將叢生芽分切為單苗，接種于繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)(表2)，根據(jù)不同培養(yǎng)基中幼苗生長(zhǎng)情況，篩選佳繼代培養(yǎng)基。

  表2 繼代培養(yǎng)基植物激素含量

  1.2.5 生根培養(yǎng)基的選擇 將幼苗叢生芽分切成約1.5 cm長(zhǎng)的單株，分別接種于含0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度23 ℃，光照度2 000 lx，光照時(shí)間13 h。3周左右即可誘導(dǎo)生根。觀察不同培養(yǎng)基生根情況，根據(jù)生根誘導(dǎo)率，確定佳生根培養(yǎng)基。

  2 結(jié)果與分析

  2.1 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基篩選

  由表3可知，不同激素濃度的培養(yǎng)基誘導(dǎo)甜菜叢生芽再生的效果不同。在16種不同激素濃度的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)率高的是14號(hào)培養(yǎng)基，其誘導(dǎo)率達(dá)10.3%。因此佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基成分確定為MS+0.7 mg/L NAA+1.2 mg/L KT。

  表3 甜菜葉柄在不同培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率

  2.2 不同外植體再生性比較結(jié)果分析

  將甜菜雄性不育系無(wú)菌苗的3種類(lèi)型外植體，分別接種于篩選出的佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中。由表4可知，葉柄的誘導(dǎo)率高，達(dá)10.8%，明顯高于叢生芽塊的4.2%和下胚軸的6.7%。因此確定佳的外植體為葉柄。

  表4 不同類(lèi)型外植體的誘導(dǎo)率

  2.3 繼代培養(yǎng)基篩選結(jié)果分析

  將生長(zhǎng)狀況相似的健壯甜菜雄性不育系叢生芽接種于不同植物激素類(lèi)型和含量的繼代培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)狀況差異較大。由表5可知，添加MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT培養(yǎng)基中叢生芽生長(zhǎng)速度快，植株健壯，無(wú)玻璃化、褐化等現(xiàn)象出現(xiàn)，但隨著KT含量的增加，叢生芽出現(xiàn)不生長(zhǎng)甚至死亡的現(xiàn)象。接種于含有6-BA激素的培養(yǎng)基中的叢生芽陸續(xù)出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，且隨著6-BA含量的增加，玻璃化現(xiàn)象更加明顯。因而，確定繼代培養(yǎng)基成分為MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT。

  2.4 生根培養(yǎng)基篩選結(jié)果分析

  將生長(zhǎng)健壯的叢生芽接種在含有不同濃度NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，由表6可知，當(dāng)NAA低濃度時(shí)生根誘導(dǎo)率隨著NAA濃度的升高而增加，NAA濃度為1.2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率高，達(dá)到83.33%。然而，隨著NAA濃度的持續(xù)升高，生根誘導(dǎo)率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因而確定佳生根培養(yǎng)基為MS+1.2 mg/L NAA。

  表5 不同繼代培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況

 表6 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根結(jié)果

  3 結(jié)論與討論

  本研究以甜菜雄性不育系32467為材料，對(duì)甜菜無(wú)菌苗植株再生的各個(gè)因素進(jìn)行研究，建立了甜菜雄性不育系植株再生體系。乙醇和氯化汞消毒之前，先對(duì)打磨后的種球進(jìn)行熏蒸，可明顯降低污染率;誘導(dǎo)叢生芽再生率高的外植體是葉柄;篩選出的優(yōu)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基MS+0.7 mg/L NAA+1.2 mg/L KT;篩選出的優(yōu)繼代培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT;篩選出的優(yōu)生根培養(yǎng)基為MS+1.2 mg/L NAA。