組培中污染產(chǎn)生的原因及防治措施

二、防止污染的方法

(一)認(rèn)真做好外植體的選擇和消毒工作，防止外植體帶菌

對外植體的選擇要考慮選擇的時間和部位，盡量選取帶菌少的材料，在時間上一般在植株的生長旺盛季節(jié)如春季和秋季病原微生物數(shù)量相對要少些，對于外植體的部位一般以幼嫩的部位較好。另外要做好外植體的消毒工作，目前外植體消毒常用藥劑有：70%～75%的乙醇溶液，0.3%～0.6%的次氯酸鈉溶液和0.1%的升汞溶液，選用何種消毒劑和消毒時間要根據(jù)外植體的幼嫩程度和部位確定，一般要求既將外植體表面的微生物殺死，又要求盡可能少傷害外植體組織和表層細(xì)胞。在生產(chǎn)實踐中防止外植體污染，也可實行多次滅菌和交替滅菌相結(jié)合的辦法，終達(dá)到消滅雜菌的目的。

(二)改善接種室和培養(yǎng)室的環(huán)境條件，保證接種與培養(yǎng)環(huán)境清潔無菌

與外植體自身帶菌所產(chǎn)生的污染相比,操作污染和環(huán)境污染是可以克服的。在組培生產(chǎn)中，真菌的污染一般與環(huán)境有關(guān)，細(xì)菌污染與接種材料及工具有關(guān)。生產(chǎn)中要通過定期做好對接種室與培養(yǎng)室消毒工作，減少環(huán)境中的微生物數(shù)量，減輕對污染的危害，為此，在接種前接種室要認(rèn)真做好消毒工作，且超凈工作臺在接種前，認(rèn)真擦洗，紫外燈要開20～30min左右。培養(yǎng)室的相對濕度應(yīng)控制在70%左右，對每件物品放到超凈工作臺上，都要用75%酒精認(rèn)真擦洗一遍，方可放到臺面上，只有這樣在一定程度上可控制污染程度。

(三)操作人員嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程

接種人員在接種操作中，應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范要求。接種人員的工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品要定期進(jìn)行濕熱滅菌，在超凈工作臺的操作區(qū)內(nèi)，不要放入過多的待用物品，避免氣流被擋住產(chǎn)生污染。定期清洗或更換超凈工作臺過濾器，接種前15～20min打開風(fēng)機(jī)，風(fēng)速調(diào)整到20～30m/min，并對臺面用75%酒精噴霧消毒，工作人員進(jìn)入操作室前必須對工作服、鞋帽進(jìn)行消毒處理，進(jìn)入接種室必須換上消毒過的鞋帽，接種前，接種人員必須認(rèn)真洗手，還要用70%的乙醇棉球擦拭雙手，只有接種過程中嚴(yán)格遵守操作要規(guī)范，才可避免因人為因素造成污染。

(四)培養(yǎng)基及接種工器具要嚴(yán)格滅菌，確保滅菌質(zhì)量

在對培養(yǎng)基和接種工具滅菌時，要先檢查滅菌鍋的使用情況，發(fā)現(xiàn)問題要立即檢修。在滅菌過程中要絕對保證滅菌應(yīng)達(dá)到的壓力、時間，確保滅菌質(zhì)量。一般要求壓力應(yīng)達(dá)到0.1個大氣壓，時間維持在15～20分鐘，并且壓力表降到零后不能馬上出鍋，防止外界環(huán)境的冷空氣倒吸入已滅菌的培養(yǎng)瓶內(nèi)引起真菌污染，應(yīng)待鍋內(nèi)稍冷卻后再出鍋。對組培生產(chǎn)過程中培養(yǎng)容器封口采用塑料蓋、膠塞、棉塞、薄膜等材料，在使用前要認(rèn)真做好清冼和消毒工作，不符合要求堅決不用。在分裝培養(yǎng)基時，勿觸瓶口，防止培養(yǎng)基粘在瓶口上，引起污染，瓶口封好后要檢查封口是否破損，扎瓶口位置適當(dāng)，松緊適宜。對已污染組培瓶要經(jīng)高壓滅菌后再清洗。

(五)在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素

這是目前較常用的方法，抗生素可以直接加入到培養(yǎng)基中，也可以用抗生素噴灑或浸泡外植體。但植物種類不同，所用抗生素的種類、濃度和處理時間也不同，因此必須對不同植物采用不同的抗生素的種類、濃度和處理時間進(jìn)行實驗探討。一般情況下，為消除革藍(lán)氏陽性菌對有些木本植物污染莖段組培苗，可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素、頭孢等混合物，可使細(xì)菌完全被消除。另外用頭孢菌素Ⅱ消除某些觀賞植物外植體中的內(nèi)生菌也有非常明顯的效果。

(六)利用病毒在植株體內(nèi)分布不均勻的原理，生產(chǎn)脫毒苗

主要是針對在植物內(nèi)部寄生的病毒，因病毒在生長點(diǎn)區(qū)域幾乎不存在，且病毒也難以長到頂芽的分生組織，所以切取頂芽的分生組織進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過組織培養(yǎng)技術(shù)就可培養(yǎng)成無病毒植株，而且脫毒效果好，后代遺傳性穩(wěn)定，所以是目前生產(chǎn)無病毒苗安全、重要的一條途徑。

(七)利用培養(yǎng)基中高鹽或高糖的濃度，抑制微生物的生長

在培養(yǎng)基中有一些高鹽或高糖的濃度可抑制微生物生長，或單寧酸存在時也可以達(dá)到抑制微生物生長的效果。

(八)減少培養(yǎng)基中的某些有機(jī)成分，可抑制微生物的生長繁殖

培養(yǎng)基中有機(jī)物如VB1、VB6、煙酸等有機(jī)成分，是某些細(xì)菌生長的必需物質(zhì)，除去這些有機(jī)物后，細(xì)菌無法生長發(fā)育，逐漸死亡減少。這樣也可在一定程度上減輕污染所帶來的危害。

總之，組培生產(chǎn)中污染的發(fā)生是不可忽視的環(huán)節(jié)，在生產(chǎn)過程中思想上要高度重視，行動上要有嚴(yán)格遵守操作規(guī)范，才能在一定程度上減輕污染所帶來的危害。